**人胰腺癌细胞HPAFⅡ培养指南**

一、细胞培养条件

细胞名称：人胰腺癌细胞HPAFⅡ
生长特性：贴壁生长
冻存条件：无血清冻存液
培养体系：MEM中加入10% FBS、1%丙酮酸钠、1% L-谷氨酰胺、1% P/S
贴壁传代方法：推荐首次传代比例为1:2。每两天更换培养液。

备注：请用无菌离心管收集培养基，以作为对比实验的依据。如果对比培养效果不佳，建议直接选购我们的完全培养基。

二、细胞处理方法

收到细胞后，培养至健康状态后用完全培养液灌满细胞瓶，并封好瓶口，以确保运输细胞的最佳状态。在处理前，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶以进行消毒，然后置于超净工作台内进行无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，让细胞状态稳定后再进行其他操作。使用显微镜观察细胞生长情况，并在不同倍数下拍照保存（建议40x、100x与200x各拍摄一张），前三天的照片是售后服务的重要依据，未提供照片视为收到状态正常。

（值得注意的是，传代后建议保留一瓶使用原瓶完全培养基，另一瓶使用自配完全培养基，以便进行对比培养，换液后请轻松扭松瓶盖。）

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

如细胞未超过80%的汇合度，需将培养瓶内的完全培养液收集至离心管中，并保留5ml完全培养基以置于37℃、5% CO2孵箱中培养；如细胞密度超过80%，则可进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞，如大部分细胞变圆并脱落，迅速取回并轻敲培养瓶，加入5ml以上完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，悬液转移至15ml离心管中，并以1000 RPM的速度离心5分钟，弃去上清液，并补加1-2ml完全培养基重新悬浮。
4. 按照比例为1:2分瓶传代（两个T25瓶），补充至每瓶5-8ml的新完全培养基，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，使用PBS清洗细胞一次。
2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，倒置观察，待细胞收缩并变圆后，加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打以使细胞脱落，转移至15ml离心管中并以1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清液，向沉淀的细胞中加入1ml尊龙凯时-人生就是博的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱保存，如后期需转入液氮罐中，则需先在-80℃冰箱中存放24小时以上。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），迅速放入37℃水浴中解冻，直至冻存管内无结晶，然后用75%酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移入含5ml完全培养基的15ml离心管中，以1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清液，重悬细胞于5ml完全培养基中并接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
4. 第二天更换新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

某些细胞可能在运输过程中发生脱落，这是正常现象。如果脱落较多，请将培养瓶内的培养液收集至离心管中，以1000 RPM离心5分钟，收集上清液进行过渡培养。沉淀的细胞可加入1-2ml胰蛋白酶、轻轻吹打后重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应，再离心，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。遵循1:2的比例进行分瓶传代，补充5-8ml新完全培养基，最后置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

五、售后条款

1）可重发情况

以下情况可申请重发：
1. 细胞在运输过程中遇到问题，如丢失、瓶身破损或培养液严重泄漏。
2. 细胞污染，请在收到产品48小时内提供真实的实验结果，经核实后可重发。
3. 常温运输细胞静置24小时，或干冰冻结运输细胞复苏后未存活，需提供细胞状态照片以便重发。
4. 若发现细胞污染，且是在干冰冻结运输后的24小时内，或常温运输细胞未开封且静置4小时的情况，均可重发。
5. 细胞活性问题，请在7天内提供真实的实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力。
6. 收到细胞当天及第2、3天请拍照记录，未告知视为产品合格。
7. 4-7天内如出现问题，需提供收到细胞前3天的照片、出现问题时的照片及相关操作步骤，经技术人员判定为我方责任的可重发。

2）不予重发情况

以下情况将不予重发：
1. 客户原因导致细胞污染。
2. 不当操作造成细胞状态不佳。
3. 非推荐的细胞培养体系导致细胞状态不好。
4. 未提供细胞培养前3天的照片。
5. 细胞培养经历其他处理。
6. 收到2天内未告知问题。
7. 视具体情况而定。