IPS诱导肠类器官的培养分为三大步骤：人多能干细胞的培养、内胚层分化以及中/后肠的模式化诱导。在本文中，我们将重点介绍第二步骤——内胚层的分化及中/后肠的模式化诱导。

一、前期准备

1. 试剂与设备
- 细胞：H1/H9 hESC或患者来源的iPSCs。
- 培养基：人多能干细胞培养基（abs9403）、RPMI1640（abs9484）。
- 消化液：人多能干细胞消化液（abs9409）。
- 培养基添加剂：L-丙氨酰-L-谷氨酸溶液（2mM）（abs9295）、双抗（abs9244）。
- 生长因子：Activin A（100 ng/mL）（abs05801）、FGF4（500 ng/mL）（abs06269）、WNT3a（500 ng/mL）（abs05632）。
- 基质胶：即用型基质胶（培养板包被）（abs9410）、类器官专用基质胶（abs9495）。
- 血清：透析胎牛血清（abs945）。
- 关键设备：表面培养皿、立体显微镜、无菌手术刀、预冷微量离心管。

2. 试剂配制
- 内胚层分化培养基：
   a. Day1：RPMI1640 + L-丙氨酰-L-谷氨酸溶液（2mM） + 双抗（1%） + Activin A（100 ng/mL）。
   b. Day2：Day1配方 + 透析胎牛血清（0.2%）。
   c. Day3：Day1配方 + 透析胎牛血清（2%）。
- 中/后肠分化培养基：
   a. RPMI1640 + 透析胎牛血清（2%） + FGF4（500 ng/mL） + WNT3a（500 ng/mL）。

二、hPSCs传代与铺板

1. 细胞传代（耗时2小时）
- 使用人多能干细胞消化液消化hPSCs，直至边缘卷起。
- 用细胞刮刀轻柔剥离细胞团，反复吹打至1-2mm大小的细胞团。
- 按1:6的比例接种至Matrigel包被的24孔板（每孔约5000个细胞团）。
- 轻敲培养板，使细胞均匀分布，置于37°C过夜培养。

2. 细胞扩增至85-90%融合（3-4天）
- 每日更换人多能干细胞培养基，观察细胞密度。
- 关键：密度过高（自发分化）或过低（分化效率低）时需重新铺板。

三、内胚层分化（3天）

1. Day1：吸除人多能干细胞培养基，加入Day1内胚层培养基（无血清），培养24小时。
2. Day2：更换为Day2内胚层培养基（含0.2%透析胎牛血清），培养24小时。
3. Day3：更换为Day3内胚层培养基（含2%透析胎牛血清），培养24小时。
4. 验证分化效率（可选）：免疫染色检测FOXA2/SOX17双阳性细胞（效率应达到85-90%）。

四、中/后肠模式化（3-4天）

1. 诱导球状体形成
- 吸除内胚层培养基，加入中/后肠分化培养基，每日更换。
- 48小时后：在立体显微镜下观察上皮增厚，72-96小时后球状体（spheroids）脱离单层细胞。

2. 收集球状体
- 使用200μL枪头收集游离的球状体，每管约50个，置于冰上备用。

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- abs9403 人多能干细胞培养基 (500ml)
- abs9409 人多能干细胞消化液 (100mL)
- abs9295 L-丙氨酰-L-谷氨酸溶液（100×，200mM） (100mL)
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